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ELISA原理
                                                                                                                          通过抗原-抗体特异性结合，将待测物与酶连接，并通过酶促反应产生颜色变化，实现抗原或抗体的定量测定。该技术基于固相化抗原或抗体与酶标记物的结合，通过颜色深浅反映待测物含量，具有高度的特异性和敏感性，适用于生物医学领域的快速检测。ELISA方法可以用于测定抗原，亦可以用于测定抗体。
酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay)，简称 ELISA，
ELISA分类
描述
  • 直接法（Direct ELISA）
    将抗原直接固定在固相载体上，加入稀释好的特异性的酶标抗体，即可测定蛋白总量。
  •
    间接法（Indirect ELISA）
    将抗原连接在固相载体上，抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合。
  •
    双抗夹心法（Sandwich ELISA）
    被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体固定于固相载体上，即捕获抗体。另一个则是检测抗体。
  •
    竞争法（Competitive ELISA）
    竞争性ELISA中固定量的酶标抗原与样品抗原竞争与固定化抗体的结合，信号与样品中抗原的浓度成反比。
描述
ELISA组成


  • ELISA试剂盒、样品槽、超纯水、量筒、烧杯、刻度移液管、单通道移液器、多通道移液器、移液器吸头、酶标仪、自动洗板机、统计计算机。

  • 若无试剂盒则还需要：微孔板、捕获抗体、偶联生物素抗体(检测抗体)、链霉亲和素-HRP(HRP，辣根过氧化物酶)、包被缓冲液、清洗缓冲液、样品稀释液、标准品稀释液、四甲基苄啶溶液(TMB，显色液)、硫酸溶液(终止液)、蛋白标准品、透气封板膜。





碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）可脱去底物磷酸单酯、双磷酸盐和多磷酸盐等磷酸化合物中的磷酸基团，在ELISA反应体系中催化对硝基苯基磷酸酯（p-Nitrophenyl phosphate, pNPP）的显色反应中， ALP 将无色的 pNPP 水解为黄色的对硝基苯酚（p-Nitrophenol, pNP）。


辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）是最为常用的标记酶，稳定性好且易于获得。它可催化 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine, TMB）显色反应中，HRP/H2O2 氧化无色的 TMB 为蓝色氧化产物 oxTMB。


除了最常用的标记酶 HRP 和 ALP 外，其它酶如葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOx）等，也可作为ELISA中的标记酶。
以常见的双抗夹心法ELISA为例：
此外，根据 ELISA 中使用标记酶的不同，可分为 ALP、HRP 和其它酶等。
1. 以ALP作为标记酶的ELISA
2. 以HRP作为标记酶的ELISA
3. 基于其它标记酶的ELISA
ELISA检测
针对不同的应用场景可以选择不同的检测方法，例如比色、荧光、化学发光等均可作为响应信号。


比色法是一种基于光的吸收特性的检测方法，它依赖于比色（或显色）底物与酶反应后生成的有色副产物。这些有色副产物的颜色深浅与待测物质的浓度成正比，可以使用吸光度酶标仪来检测待测物质的浓度。


在荧光法中，荧光底物与酶反应后产生高荧光强度的副产物。这些副产物的荧光强度与样品中待测物质的量成正比。因此，通过测量荧光强度，可以使用荧光酶标仪来检测待测物质的浓度。


化学发光法是一种基于化学能转化为光能的检测方法。在化学发光法中，化学发光底物与酶反应后产生发光副产物。这些发光副产物的光子发射强度与待测物质的浓度成正比，因此可以使用光度计进行检测。
1. 比色法
2. 荧光法
3. 化学发光法
ELISA结果
ELISA测定结果通常可划分为以下几类：


此类型测定主要用于判断样品中是否存在特定的抗原。在检测过程中，通常设置一个不包含抗原或包含无关对照抗原的空白孔作为参照。


这种ELISA方法允许对多个样品之间的抗原水平进行相对的比较，但无法提供精确的浓度值。


定量ELISA能够计算出样品中特定抗原的精确浓度。这种测定方法需要比较由样品测定得到的数值与已知浓度的纯化抗原系列稀释液所得的标准曲线。定量ELISA是ELISA测定中最常用的一种，能够提供准确的定量分析数据。


描述
1. 定性ELISA
2. 半定量ELISA
3. 定量ELISA
标准曲线示例图：
注意事项
1. 采集血清标本时，要注意防止溶血现象的发生，并且尽量在血清新鲜时进行检测，以保证结果的准确性。

2. 若样品中存在细菌污染，菌体中可能含有的内源性HRP导致假阳性反应。

3. 若待测样品无法立即检测，建议将样品分装并储存于-20℃或-80℃的低温环境中，同时避免反复冻融，以保持样品的稳定性。

4. 在进行加样时，请避免过快的加样速度，确保加样的准确性和均一性，建议匀速进行加样操作。

5. 加样时应确保直接加入反应孔的底部，避免加在反应孔壁上，以免溅出并污染邻近的反应孔。

6. 手洗板进行洗涤时，请确保洗涤液不会溢出孔外，以防止污染相邻的孔。

7. 在甩掉洗液时，请注意动作的迅速和干脆，避免手腕的左右摇摆或旋转，以减少液体的飞溅和污染。

8. 一些底物如OPD和TMB在暗处更为稳定，因此底物溶液应现用现配，并在酶促反应过程中注意避光操作。

9. 请勿让酶标仪暴露在强光下，使用前建议先预热仪器15-30分钟，以确保测读结果的稳定性。

10. 若样品的OD值超过标准曲线的上限，建议适当稀释后重新测定，并在计算浓度时乘以样品的稀释倍数，以获得准确的结果。
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